EFFECTS OF BETA-GLUCAN ON GROWTH AND IMMUNE RESPONSE ON PENAEUS VANNMEI
Abstract: The experiment used the experimental diets added by different seven Beta-glucans.and then to feed Penaeus vannmei nearly one month.The results show that the 7 Beta-glucans improved the survival rate in different degree.the optimal effects are B4 691.4% and B5 802.4% espectivlely,then is B3 544.1%.The results show that the B5 Beta-glucan used as immunity can improve the survival rate and body-gain rate.Forthermore,the results of the composition of the muscle show that the additive will not affect the quality of the Penaeus vannmei and it is the wealthy additive to aquatic feeds. Then to determine the Bacteriolytic,antibacterial and superoxide dismutase acivities (SOD) of the muscle and hepatopancreas.The results show that the the Bacteriolytic activity of both muscle and hepatopancreas of B3,B4 and B5 are higher than that of control and other tests(P<0.01),and B5 the highest,are 0.094 and 0.1 respectively;the antibacterial activity of hepatopancreas among B3,B4,B5,B6 and B7 are almost the same (P>0.05),but they are all higher than the control (P<0.01). The superoxide dismutase acivities are B5 the highest,and then B3 and B4,they are all higher than that of the control and other tests (P<0.01). The results show that the B5 Beta-glucan can improve the non-specific immunity of Penaeus Vannamei and have widely markets.
Key words:beta-glucan, Penaeus Vannamei,growth,Immune response

　　对虾养殖业是我国海水养殖业的支柱产业，自1993年全国养殖对虾因感染对虾白斑病毒（WSSV）而发生大规模暴发性流行病以来，对虾养殖业蒙受了毁灭性的打击。到目前为止，已发现有20多种病毒可以感染虾类，而对付这些病毒至今还没有有效的方法。抗生素的使用一定程度缓解了疾病的发生，但由于它在动物体内残留，进而危害人类的健康,目前已严格限制其使用。因此水产工作长期以来一直致力于开发绿色水产饲料免疫增强剂。目前研究较多的免疫增强剂有海藻多糖[1]、细菌脂多糖[2]、肽聚糖[3]、植物活性物质、微生态制剂（如益生菌等）及β-1，3葡聚糖等[4，5，6]。从酵母细胞中提取的β-葡聚糖作为免疫增强剂已实现商品化[1]。然而其在对虾研究的应用效果至今未见报道。Itami对日本对虾，Sung等和Song等先后对斑节对虾研究均提出β-葡聚糖具有较好的抗感染能力。

　　南美白对虾（Penaeus Vannmei）因其壳薄,头胸甲小，含肉率高（53.03%-53.81%）,生长快,抗病力强,适应性好,易养殖,产量高,已成为中国养殖面积最大的对虾品种。并且因其肉质鲜美,价格适中,营养丰富,成为普通百姓餐桌上的美味佳肴。然而高密度养殖造成了养殖水体的恶化，病害的频繁发生。本试验通过在饲料中添加不同的β-葡聚糖产品依据其对南美白对虾生长及非特异性的免疫力影响，探讨其作为饲料添加剂的有效性，以期为对虾健康养殖提供参考。

1 材料与方法

1． 1试验用虾及暂养
本试验所用虾苗为南美白对虾（Penaeus vannamei）,购自广东湛江。初到虾苗充氧袋内海水比重为1．014，温度为22℃。三天后开始淡化，每天海水比重降低0.001，淡化至水的比重为1．001。每天升温1℃，温度升至27℃。暂养期间投喂初孵卤虫无节幼体，或喂红虫及单胞藻，等虾长至1cm左右时开始筛选分箱，进行正式试验。
1． 2添加剂来源
本试验所用添加剂为不同β-葡聚糖产品（B1-B7），其中B7为B6的粗制品。
1．3试验设计
试验共分八组，每组设三个平行。以基础饲料为对照组。在基础饲料中分别添加0.075%(B1-B6)、0.2%（B7）不同的β-葡聚糖为试验组。从暂养箱中选出规格整齐、健康活泼的虾苗，随机饲养于（60*40*40cm）的水族箱中，每箱放虾苗50尾。

表1 南美白对虾基础饲料配方（%）
Tab 1 The basal diets of Penaeus Vannmei（%）

1．4 试验饲料的制备
将七种β-葡聚糖产品，用研钵磨成粉末，过60目筛。将预先混合好的基础饲料原料同样过60目筛，采用逐级扩大法将β-葡聚糖产品按试验设计与基础饲料原料混合，用TJ-12型电动绞肉机制粒，过30目筛（对虾早期饲料）和过20目筛（对虾中后期饲料），4℃密封贮存备用。

1．5 饲养管理
试验时间从2002年12月4日至2003年1月6日，共33天。在整个试验期间，海水比重为1.001，水温为26.8-27.2℃，NH4-N<0.2mg/L，DO>5mg/L，pH值在7.5-8.5之间。每日投喂五次，分别为凌晨1:00、早晨7：00、中午12：00、下午5：00及晚上9：00。每天排污两次，早上和傍晚各排污一次，并同时将残饵吸出，以免污染水质。早上排污后换水，换水量为1/4-1/5。每日观察对虾吃食、游动、蜕皮、死亡情况。

1．6 测定方法及数据处理
1．6．1测定对虾的生长及存活率：
试验开始随机抽取30尾虾苗,测定其初始体长、体重,饲养33d后,测定各组每尾虾的体长、体重,并计算存活率、相对增重率、体长增长率。计算公式如下：
存活率（%）=（试验结束时虾尾数）/试验开始时虾尾数×100；
相对增重率(%)=［(试验末体重—试验初体重)/试验初体重］×100；
体长增长率(%)=［(终末体长-初始体长)/初始体长］×100。
1．6．2饲料成分测定：
饲料蛋白质测定用微量凯氏定氮法，脂肪采用索氏抽提法、灰分用马福炉灰化，水分测定用烘干法（105℃烘干至恒重）；
1．6．3 免疫功能的测定：
1.6.3.1组织匀浆液的制备
南美白对虾经33天饲养后，每个平行组各取8尾样品虾，置于冰盘内，去壳分别取其肌肉、肝胰脏和头部，以10倍的冰冻去离子水（4℃）低温条件下制成匀浆后，以3000转/分离心10分钟，取上清液进行抗菌活力、溶菌活力和SOD活力的测定。
1.6.3.2 抗菌活力
抗菌活力测定，采用Hultmark[10]等的方法加以改进。用0.1mol/L，pH=6.4的磷酸钾盐缓冲液从固体斜面上将大肠杆菌（E. coli）洗下作为底物并配成一定浓度的悬浊液（O.D.570=0.3-0.5）。取10uL肌肉匀浆后的上清液于冰浴的试管中，再加入5mL大肠杆菌液，此时混匀测O.D.570=A0值。然后将试液移入37℃温水浴中30min，再放入冰箱（4℃）10min终止反应，测定O.D.570=A。抗菌活力Ua按下式计算：
Ua= √A0-A）/A。
1.6.3.3 溶菌活力
采用Hultmark[13]等（1980）方法稍加改进。溶壁微球菌为本研究室的菌种，将经过二次活化的溶壁微球菌（Micrococcus lysoleikticus,Sigma）接种于琼脂培养基内,以溶壁微球菌为底物，将底物用0.1mol/l，pH=6.4的磷酸钾盐缓冲液配成一定浓度的悬液（O.D.570=0.3-0.5）。取10ul肌肉匀浆后的上清液，再加入5ml溶壁微球菌液，此时混匀测O.D.570值A0。然后37℃温水浴中30min，取出后放入冰箱（4℃）10min终止反应，测O.D.570值为A，溶菌活力UL按下式计算：
UL=（A0-A）/A
1.6.3.4 SOD活力
SOD活力采用南京建成生物有限公司的试剂盒直接测定，蛋白含量采用南京建成生物有限公司的试剂盒考马斯亮兰法测定。
组织匀浆中SOD活力=（对照管吸光度-测定管吸光度）× 反应液总体积
50%*对照管吸光度 取样量(ml)*组织蛋白含量
组织中蛋白含量g/L= 测定管吸光度 ×标准管浓度(g/L)
标准管吸光度
SOD活力单位:NU/mgprot

1．6．4统计分析
采用SPSS统计软件在SPSS 7.5 for windows环境下进行方差分析，用Q检验进行多重比较。

2 结果
2.1 β-葡聚糖对南美白对虾生长与存活的影响
饲料中添加β-葡聚糖对南美白对虾体长的增长率有显著影响，以B5组的增长效果最好（表3），其体长的增长率为114%，显著高于对照组、B1、B2、B6及B7组（P<0.05）。对照组与其余各试验组均无显著性差异（P>0.05）。
β-葡聚糖对南美白对虾的体重生长也有显著影响，以B4和B5组饲喂的效果最好，增重最快（P<0.05），分别为 691.4%和802.4%，显著高于对照组及其余各试验组。对照组增重率与B1、B2、B3、B6和B7组之间没有显著性差异（P>0.05）。
不同β-葡聚糖产品在不同程度上提高了南美白对虾的存活率。对照组南美白对虾的存活率最低，为22.7%；除了对照组存活率与B2组差异不显著之外，其余各组的存活率均显著高于对照组（P<0.05），其中以B5组的存活率最高，为72.0%。B3、B4和B6组对虾的存活率次之，这三组之间无显著性差异。

表3 试验虾的生长和存活
Table 3 The growth and survival of tested shrimps(MeanSD)

2．2 β-葡聚糖对南美白对虾稚虾溶菌酶活力的影响

南美白对虾稚虾肌肉和肝胰脏溶菌酶活性分别为0.035u和0.025u，不同的β-葡聚糖饲喂试验虾，无论肌肉组织还是肝胰脏溶菌酶活力，都以B5组为最高（图5和图6），分别为0.1u和0.094u，均极显著地高于对照组及其余各试验组（P<0.01），其次是B3、B4组；对照组肌肉组织溶菌酶活力最低，为0.035u，极显著地低于各试验组肌肉组织溶菌酶(P<0.01)，对照组肝胰脏溶菌酶为0.025u，与B1、B2、B6和B7组均无显著性差异。

　　　

(注：图中大写字母不同表示差异极显著(p<0.01)，小写字母不同表示差异显著(p<0.05).小写字母相同表示无显著性差异(p>0.05)Note:Figures in the same column having different capital letters are very significantly different(P<0.01),having different small letters are significantly different (P<0.05).)

2．3 β-葡聚糖对南美白对虾稚虾抗菌活力的影响
对照组肌肉和肝胰脏的抗菌活力分别为0.21u和0.18u。试验组南美白对虾肌肉组织抗菌活力，除了B1组显著高于对照组之外，其余各组都极显著地高于对照组（P<0.01）,其中B5组肌肉组织抗菌活力最高，B4组次之(图7)；对虾肝胰脏的抗菌活力除了B1、B2组与对照组没有显著性差异之外，其余各组均极显著高于对照组（P<0.01，图8）。

　　　


(注：图中大写字母不同表示差异极显著(p<0.01)，小写字母不同表示差异显著(p<0.05).小写字母相同表示无显著性差异(p>0.05)Note:Figures in the same column having different capital letters are very significantly different(P<0.01),having different letters are significantly different (P<0.05).)

2．4 β-葡聚糖对南美白对虾头部SOD活力的影响
对照组对虾头部的SOD活力为12.8NU/mgprot.,与B1、B2和B7差异不显著，与B3、B4和B5组差异极显著(P<0.01)；B5组的SOD活力最高，除了与B4组无显著性差异之外，与其余各组均有极显著性差异（P<0.01）。

　　　　　　　　　　　　　

(注：图中大写字母不同表示差异极显著(p<0.01)，小写字母不同表示差异显著(p<0.05).小写字母相同表示无显著性差异(p>0.05)Note:Figures in the same column having different capital letters are very significantly different(P<0.01),having different letters are significantly different (P<0.05).)

3 讨论

3.1南美白对虾的增重率及存活率.
　　影响南美白对虾的存活率有多种因素，如气温、试验虾是否健壮整齐、饲料状况、水质及对虾间互相残杀程度等都可以影响虾的存活率。本试验中，监控水质，水温控制在26.8-27.2℃之间，初放虾苗都挑选同一规格的健康活泼虾苗，每天投喂五次，让南美白对虾吃完吃饱。

　　刘栋辉等[5]报道，饲料中添加β-葡聚糖有助于斑节对虾的生长和存活，有利于提高饲料效率，降低饲料系数。陈云波等[6]研究表明，用添加0.4%β-葡聚糖的饲料饲喂南美白对虾，试验组增重率较对照组显著提高。本试验也获得相似的结果，饲料中添加β-葡聚糖能显著影响南美白对虾的生长和成活，不同在于B1-B7七种不同的β-葡聚糖添加的效果不同，其中以B5的效果最佳，B5组南美白对虾无论存活率和增重率都显著高于对照组和其余各试验组。其原因与β-葡聚糖组成有关，B1-B4、B6和B7是以β-1，3葡聚糖为主，且含有少而不等量的1，6-键的β-葡聚糖，B5组的葡聚糖含有大量β-1，6糖苷键为主的葡聚糖支链。由此可见，含1，6支链的β-葡聚糖促生长效果明显优于β-1，3葡聚糖。B6和B7组的主要组成相同，B6是B7经提纯后的β-葡聚糖。这两组饲养效果相同，说明β-葡聚糖的纯化没有必要，这样可以降低其成本。Sung[11](1996)报道，β-葡聚糖对对虾生长和抗病力的效果很可能是刺激血淋巴的结果，虾浸泡于Macro Gard混悬溢中时血淋巴产生更多的超氧游离基和过氧化氢，从而使得对虾形成防御屏障，抵抗疾病的入侵，提高存活率。

3．2 南美白对虾的免疫功能
　　虾类免疫系统的发育不完善，它对病原微生物的抵抗主要依赖非特异性免疫。对虾产生免疫应答的主要器官为淋巴器官和血淋巴，淋巴器具有生成和释放血细胞的功能[17]。国内外大多数学者通过提取、分离对虾血淋巴来检测免疫功能。本试验对南美白对虾稚虾进行了研究。经过一个月的养殖，个体长到4cm左右，抽血困难。鉴于对虾的血液循环系统为开放式循环系统，因此本试验取肝胰脏和肌肉、头部组织匀浆上清液进行免疫功能的测定是可行的。

　　对虾的免疫系统中存在能够识别β-葡聚糖的结合蛋白。当二者结合，其结合物与颗粒细胞膜上的受体结合，从而激活了对虾的免疫功能。溶菌酶是吞噬细胞杀菌的物质基础，它是一种碱性蛋白，能水解革兰氏阳性细胞壁中粘肽的乙酰氨基多糖并使之裂解被释放出来，形成一个水解酶体系，破坏和消除侵入体内的异物，从而担负起机体防御的功能[13]。Cheng等也报道了Mercenaria mercenaria的的血细胞在吞噬细菌的过程中，释放溶菌酶[14]。溶菌酶活性是反映动物非特异性免疫功能的重要生理指标。刘树清等在给日本对虾注射海藻多糖后，虾体血糖中溶菌酶活力显著提高[15]。本试验虾的肌肉和肝胰脏中均有溶菌酶的活性。虽然通过在饲料中添加不同β-葡聚糖饲喂南美白对虾，无论肌肉组织还是肝胰脏溶菌活力都较对照组有较大程度地提高。然而B5组的效果最佳，B3、B4组次之。 B3、B4和B5组溶菌活力与王雷[16]（1995）对中国对虾的测定结果基本一致。

　　抗菌活力是无脊椎动物免疫防御反应的另一个重要组成部分，主要存在于动物的血淋巴中。本试验的研究结果表明，除B1和B2组的肝胰脏之外，各试验组无论肌肉组织还是肝胰脏抗菌活力都较对照组有不同程度地提高，其中肌肉组织抗菌活力各组间差异较大。这与王雷[16]等认为酵母葡聚糖对抗菌活性（Ua）的影响不大，甚至无诱导作用。酵母葡聚糖是B1,3葡聚糖,因此王雷等的结果与本实验相符.王雷推测，濒死对虾抗菌活力大大下降，甚至并且检测不出溶菌活力。由此推测活力下降的原因可能是某些生物合成机制被破坏；对虾血细胞发生自溶现象，需要消耗抗菌和溶菌因子来清除，从而造成活力下降，尤其是溶菌活力的下降。本试验各组的溶菌酶活力和抗菌活力与其相应数据也能验证了这一推测。

　　SOD超氧化物歧化酶是重要的抗氧化酶之一。在消除自由基，防生物分子损伤方面有十分重要的作用。自由基参与正常生命活动如生物活性物质的合成、解毒、杀灭细菌等，正常状态下自由基的产生和消除保持动态平衡，若自由基过多，可致使机体强烈损伤，其中超氧阳离子自由基（O2-）起着至关重要的作用。SOD是一切需氧有机体清除O2-保护机体免受伤害的一种关键酶，其活性与生物的免疫水平密切相关。本试验的研究结果表明，添加B3、B4、B5能极显著提高对虾头部的SOD活力，这与刘恒等[1]在饵料中添加海藻多糖可显著提高南美白对虾SOD活性的结果相似，昆布多糖的主要成分为1,6β(1,3)葡聚糖，这与本试验结果相符。本试验中唯有含较多1，6支链的β－葡聚糖B5组提高SOD活力的效果最佳。

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